J Adv Res|浙江大学团队揭示黑木耳多糖通过肠道共生菌改善肥胖

2024-07-15

黑木耳（Auricularia auricula）是一种传统的食药两用真菌，是世界上第三大栽培食用菌，因其丰富的生物活性成分和保健作用而引起越来越多的研究兴趣。黑木耳的子实体含有丰富的多糖，在东方国家被用作食品和药物已有1000多年的历史。黑木耳的主要功能成分是多糖，具有重要的生物学作用，如抗氧化、降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤和抗病毒活性。然而，黑木耳多糖(AAP)是否对体重和肥胖相关的代谢紊乱有直接影响仍未知。

浙江大学的靳明亮团队在Journal of Advanced Research杂志上撰文，阐释AAP通过调节肠道脂质运输来抑制饮食驱动的肥胖和基于新陈代谢的疾病，这一机制依赖于肠道共生的Papillibacter cinnamivorans。

为了研究AAP对饮食诱导的肥胖的影响，小鼠进行8周HFD喂养，每天灌胃AAP或生理盐水(阴性对照)。在这8周之后，HFD组的体重显著增加，AAP从第二周起改善了饮食导致的体重增加。组织学分析证实，AAP可减少腹部脂肪沉积和脂肪细胞大小，同时肝脏和心脏重量降低，但肾和脾重量没有差异。对腹部脂肪的进一步分析表明，HFD上调脂肪生成基因(Pparγ和Cebpα)和脂肪生成基因(Acc1和Fasn)，而AAP处理下调。此外，AAP还能抑制HFD诱导的肝脏脂肪变性和血脂紊乱，表现为减少甘油三酯在肝脏内的积聚，降低血浆甘油三酯、胆固醇和LDL水平。此外，研究者还发现，AAP可以缓解HFD诱导的高血糖，表现为在OGTT过程中血糖水平较低，这表明AAP增强了摄入后葡萄糖的清除。为了进一步阐明AAP对HFD诱导的肥胖和相关代谢紊乱的影响，研究者进行了代谢组学分析，比较了HFD小鼠和服用AAP的小鼠的血清代谢组，并以喂LFD（低脂饮食）的小鼠为对照。发现HFD、HFD+AAP和LFD喂养的小鼠之间的血清代谢物得到了明确的分离。对单个代谢物的进一步分析表明，经HFD升高的11种代谢物的含量被AAP完全逆转至正常水平。代谢通路分析表明，显著变化的几种代谢物与参与脂肪酸代谢的代谢通路有关。总之，这些结果表明，口服AAP预防HFD诱导的肥胖及其代谢紊乱，可能是通过与脂肪酸代谢有关。

口服AAP可避免饮食引起的肥胖和代谢紊乱

为了确定肠道微生物群是否在AAP诱导的肥胖和相关疾病的影响中发挥作用，将HFD小鼠灌胃抗生素鸡尾酒处理。当小鼠接受抗生素处理时，AAP未能减弱HFD诱导的体重增加，在器官重量中结果类似。使用或不使用APP处理的小鼠的脂肪在腹部脂肪重量、脂肪细胞大小或脂肪生成相关基因的表达方面也没有差异。此外，抗生素处理消除了AAP对HFD诱导的代谢紊乱的影响，包括肝脏TG水平、循环TG水平、TCHO和LDL水平以及葡萄糖耐量。总之，AAP的抗肥胖作用依赖于多样的肠道微生物群落的存在。

肠道微生物群对AAP抗肥胖至关重要

为了进一步阐明肠道微生物群在AAP诱导效应中的作用，采用FMT进行验证。来自HFD小鼠的粪便微生物群被移植到HFD受体小鼠中。与对照组小鼠相比，AAP处理的小鼠的FMT显著降低了体重增加和器官重量。然而，AAP加抗生素处理的小鼠的FMT受体小鼠与HFD小鼠没有区别。同样，与HFD-FMT受体小鼠相比，AAP-FMT受体小鼠的肝脏和循环甘油三酯，以及血清T-CHO和LDL水平显著低于HFD-FMT受体小鼠，这表明AAP影响的粪便微生物群落的移植也降低了脂肪代谢。研究者进一步分析了腹部脂肪沉积和脂肪生成相关基因的表达水平。发现HFD对照组和AAP+抗生素处理的小鼠的FMT受体小鼠各基因之间表达水平没有显著差异，而接受AAP-FMT的小鼠的基因表达水平显著降低。此外，AAP-FMT受体小鼠的血糖上升也明显减少，而抗生素处理消除了了AAP-FMT的影响。这些发现进一步证实了微生物群在AAP的抗肥胖作用中的作用。

来自AAP处理小鼠的FMT减少了HFD小鼠的肥胖和代谢紊乱。

为了进一步了解肠道微生物群在AAP减肥中的作用，研究者通过16S rRNA基因扩增序列分析了肠道微生物群的组成。虽然α多样性在组之间没有差异，但组间的β多样性，如PCoA所示，根据处理组显示出四个独立的簇，这表明肠道微生物群组成对HFD、AAP和抗生素干预的反应存在差异。Lefse分析用于鉴定AAP在HFD小鼠体内影响的微生物分类群。在属水平上，与LFD相比，HFD改变了8个属(增加了5个属，减少了3个属)，包Lachnoclostridium, 肠球菌属, Negativibacillus, 嗜水气单胞菌, Hypnocyclicus, Candidatus，Bacilloplasma, Papillibacter和双歧杆菌。与HFD小鼠相比，AAP治疗显著降低了Mucispirillum的水平，增加了可被抗生素消除的Peptococcus, Muribaculum, Anaerovorax和 Papillibacter,的水平。值得注意的是，只有Papillibacter的水平被HFD抑制，并可以被AAP恢复。研究者通过GenBank序列数据库检索AAP组与其他HFD组差异显著的OTUS。在全部范围内，71个菌OUT被HFD显著影响，而AAP移动了影响了83个菌OTU。进一步评估了三个不同实验组之间的OUT交集，包括正常饮食与HFD组，HFD组与HFD+AAP组，以及HFD+AAP组与HFD+AB+AAP组。得到了16个OTUS，包括P. cinnamivorans, Parabacteroides goldsteinii, Alistipes putredinis, Clostridium saccharolyticum, Caprobacter fermentans, Clostridium thermocellum, Massilimaliae timonensis, Clostridium fessum, Acetatifactor muris, Paramuribaculum intestinale, Aminipila butyrica, Clostridium indolis, Clostridium celerecrescens, Muribaculum intestinale, Kineothrix alysoides和 Faecalicatena orotica。因此，该研究集中在肥胖相关趋势与通过AAP调节的细菌种类的肠道水平相关的可能性上。相关分析表明，OTU17(P.Golddsteinii)、OTU22(A.putredinis)和OTU56(P.Cinnamivorans)与肥胖显著负相关。这些结果表明，AAP以肠道微生物群特异性的方式调节HFD诱导的肥胖。

AAP治疗肥胖小鼠肠道微生物群的变化

由于AAP的减肥效果可以通过FMT转移，因此通过对受体粪便样本进行16S rRNA基因组测序，评估了转移供体粪便微生物区系对微生物多样性的影响。结果发现主要不影响微生物区系的α多样性(图5A)。为了说明FMT处理对β多样性的影响，研究发现HFD、AAP和抗生素组之间存在显著差异，这表明FMT复制了AAP对HFD诱导的肥胖小鼠肠道微生物区系的影响。研究者共鉴定出54个差异较大的菌属，其中14个属是三组间共有的。在这些属中，与AAP-FMT受体相比，经抗生素处理的受体小鼠粪便菌落显著改变了9个属，包括Aerosphaera, Gemella, Coriobacteriaceae, Facklamia, Corynebacterium, Kurthia, Aerococcus, Ruminococcaceae, Glutamicibacter，而在移植HFD小鼠粪便微生物群的小鼠中，7个属受到调控，包括Psychrobacter, Ruminococcaceae, Glutamicibacter, Eubacterium nodatum group, Fusobacterium, Faecalibacterium, Prevotella。此外，利用GenBank序列数据库，研究者分析了三组间OTUS的差异。与HFD-FMT相比，AAP-FMT处理的小鼠中有26个OTU被确定为移位物种，与AAP-FMT处理的小鼠相比，抗生素-FMT处理的小鼠中有24个OTU发生了改变。发现除了OTU277_Roseburia enterinalis外，与HFD-FMT队列相比，AAP-FMT队列中有五个OTU重叠增加，但是在抗生素-FMT队列中没有增加。AAP和AAP-FMT治疗的小鼠出现了肥胖减轻，因此，在这两个组的粪便样本中都应该存在抗肥胖的肠道共生功能细菌。令人惊讶的是，从这两种测序方法的比较中只发现了OTU5_P. cinnamivorans。相关分析的结果表明，P. cinnamivorans的相对丰度与肥胖趋势呈负相关。这些数据表明，P. cinnamivorans可能是AAP在减少HFD诱导的肥胖方面的关键因素。

P. cinnamivorans被确定为AAP降低饮食诱导的肥胖的关键细菌

为了证实P. cinnamivorans促进了HFD小鼠的抗肥胖作用，研究者每天给药HFD小鼠一种商品化的P. cinnamivorans或生理盐水(对照)，持续8周。在4周的处理后，粪便样本中的P. cinnamivorans的相对丰度显著增加。此外，相对于HFD小鼠，体重增加有所减弱，这些影响持续到研究的最后4周。P. cinnamivorans处理有效地减少了HFD诱导的肥胖特征，如肝脏和腹部脂肪重量，同时脂肪细胞的平均大小和腹部脂肪组织的平均脂肪细胞面积减少。然后，研究者通过比较对照组和P. cinnamivorans处理的小鼠，评估了腹部脂肪中脂肪代谢相关基因的表达。发现P. cinnamivorans也显著降低了Cebpα和Pparα的表达。此外，与HFD小鼠相比，P. cinnamivorans处理的小鼠葡萄糖耐量改善。表明P. cinnamivorans处理可以保护小鼠免受HFD诱导的肥胖和代谢紊乱的影响。

P. cinnamivorans的治疗保护小鼠免受饮食驱动的肥胖和代谢紊乱的影响。

在确定P. cinnamivorans可以减轻肥胖表型之后，研究者试图探索这些效应背后的机制。因此，研究者进行了批量RNA测序(RNA-seq)分析，以更全面地分析LFD小鼠、HFD喂养小鼠和HFD-P. cinnamivorans小鼠结肠组织的基因表达谱。与HFD组相比，在P. cinnamivorans治疗组获得的2571个基因中，1335个上调，1236个下调。KEGG富集分析表明，炎症相关通路位于HFD与LFD和P. cinnamivorans与HFD的两个簇的重叠处，包括JAK-STAT信号通路、抗原处理和呈递、炎症性肠病和趋化因子信号通路。因此，为了进一步究P. cinnamivorans在HFD介导的肠道炎症中的作用，研究者测定了肠道炎症反应。H&E染色形态分析显示HFD可引起较大的组织损伤，表现为肠上皮层广泛溃烂、水肿、肠壁隐窝破坏以及粘膜内粒细胞和单核细胞的渗入。相反，P. cinnamivorans处理减少了HFD诱导的结肠炎的组织学病变。为了研究P. cinnamivorans对HFD诱导的炎症反应的影响，研究了炎症标记物的表达。P. cinnamivorans处理显著降低了促炎细胞因子的表达，如TNFa、IL6和IL18。为了验证这些结果，研究者分析了结肠和血清中的TNF-α和IL-6的分泌，这与基因表达的结果是一致的。此外，为了更深入地了解P. cinnamivorans抗炎作用的分子机制，研究者对JAK-STAT信号通路进行了基因集浓缩分析(GSEA)。数据显示，通过分析JAK1、JAK3、AKT3、STAT1和STAT4的转录水平，P. cinnamivorans处理显著抑制了HFD小鼠JAK-STAT信号的激活。提示P. cinnamivorans可通过JAK-STAT信号转导途径抑制HFD诱导的肠道炎症反应。为了研究肉桂嗜酸杆菌对肠道通透性的影响，研究者用免疫荧光染色和透射电子显微镜观察了紧密连接的形成。透射电子显微镜观察显示，HFD小鼠肠道组织连接不清，密度降低，细胞间隙变宽，而P. cinnamivorans处理对HFD诱导的肠道损伤具有保护作用。通过对紧密连接标志物Claudin-1、occludin和ZO-1细胞层的免疫荧光染色，表明存在紧密连接复合体。此外，P. cinnamivorans处理有效地恢复了ZO-1的表达，但不能恢复Claudin-1和occludin的表达。与HFD小鼠相比，P. cinnamivorans处理组小鼠的血清内毒素或LPS水平也显著降低，这表明P. cinnamivorans治疗降低了HFD小鼠的肠道通透性。因此，P. cinnamivorans在肥胖动物体内的抗肥胖和抗炎作用与肠道屏障功能增强有关。

P. cinnamivoran可减轻HFD诱导的肥胖小鼠的炎症反应并增强肠道屏障功能

与HFD小鼠相比，HFD+P. cinnamivorans处理后的表达降低的基因也显著富集了与脂肪代谢相关的通路，如脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延长和亚油酸代谢。因此研究者进一步研究P. cinnamivorans是否通过调节肠道脂肪吸收来调节HFD小鼠的抗炎和抗肥胖作用。利用qPCR分析，研究者证实了在P. cinnamivorans处理的小鼠中，结肠和空肠关键脂转运蛋白的mRNA（MTP、ABCA1、FATP4和NPC1）编码减少。这一变化与血清TG、TC和FFA水平显著降低有关。随后，研究者将肝脏转录本分为三组。从KEGG结果可以发现，在P. cinnamivorans（PC）_UP和HFD中，存在某些与肥胖有关的KEGG通路，特别是产热通路。因此，研究者研究了实验中关于产热通路相关基因表达的数据。发现与生理盐水对照组相比，P. cinnamivorans处理组小鼠肝脏中与产热信号相关的基因上调。为了进一步考察P. cinnamivorans对肝脏产热的影响，对肝脏切片分别进行HE染色和透射电子显微镜观察。发现P. cinnamivorans处理改善肝脏脂肪变性，减轻HFD诱导的脂肪沉积。且P. cinnamivorans处理的小鼠TG水平较低。这些数据进一步证实了P. cinnamivorans在AAP抗肥胖作用方面的作用，AAP通过调节肠道脂肪吸收和肝脏产热来减轻肥胖。

P. cinnamivorans通过调节肠道脂肪吸收和肝脏产热来减轻由高脂饲料引起的肥胖

总之，该小鼠体内研究的结果表明，AAP（黑木耳多糖）通过微生物群依赖的方式调节炎症反应、肠道通透性和肠道中的脂肪运输/代谢来减轻肥胖和相关的代谢失调。这些发现为AAP作为益生菌的应用提供了基础，同时也表明有必要进一步评估肠道共生P. cinnamivorans作为潜在的下一代益生菌治疗和预防肥胖症及其代谢共病的必要性。

实验模型的示意

文献链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37549868/

DOI： 10.1016/j.jare.2023.08.003

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